Functionele genomica in Leishmania-promastigoten die zijn afgeleid van zandvliegen

Functionele genomica in Leishmania-promastigoten die zijn afgeleid van zandvliegen

mei 19, 2019 0 Door admin
  • Statistieken laden

  • Pedro J. Alcolea,
  • Ana Alonso,
  • Ricardo Molina,
  • Maribel Jiménez,
  • Peter J. Myler,
  • Vicente Larraga
PLOS

X

Abstract

Achtergrond

Leishmania- ontwikkeling in de zandvlieg leidt tot zeer infectieuze vormen die metacyclische promastigoten worden genoemd. Dit proces kan routinematig in cultuur worden nagebootst. Genexpressieprofileringstudies door transcriptoomanalyse zijn uitgevoerd met het doel promastigote vormen in de zandvliegdarm te bestuderen, evenals verschillen tussen zandvlieg- en kweekafgeleide promastigoten.

bevindingen

Transcriptome analyse heeft de cruciale rol van de micro-omgeving in de ontwikkeling van parasieten in de zandvlieg gemaakt, omdat er substantiële verschillen en matige correlatie tussen de transcriptomen van gekweekte en van zandvlieg afgeleide promastigoten zijn gevonden. Met zandvliegen afgeleide metacyclische stoffen zijn meer infectief dan metacyclische kweken. Daarom moet enige voorzichtigheid worden betracht bij het gebruik van gekweekte promastigotes, afhankelijk van het experimentele ontwerp. De meest opmerkelijke voorbeelden zijn de hydrofiele zure oppervlakte-eiwit / kleine endoplasmatisch reticulumproteïne ( HASP / SHERP ) -cluster, de glycoproteïne 63 ( gp63 ) en autofagie-genen, die opwaarts worden gereguleerd in van zandvlieg afgeleide promastigoten in vergelijking met gekweekte promastigoten. Omdat HASP / SHERP- genen opwaarts gereguleerd zijn in nectomonad en metacyclische promastigoten in de zandvlieg, zijn de gecodeerde eiwitten niet metacyclisch specifiek. Metacyclische promastigoten onderscheiden zich door morfologie en hoge infectiviteit. Het isoleren van hen uit de zandvlieg is niet vrijgesteld van technische problemen, omdat andere promostigote vormen zelfs 15 dagen na infectie in het darmkanaal blijven. Grote procyclische promastigoten van Leishmania in de zandvlieg reguleren genen die betrokken zijn bij regulering van de celcyclus en glucose-katabolisme, terwijl metacyclische genen transcriptieniveaus van vetzuurbiosynthese en ATP-gekoppelde protontransportgenen verhogen. De signaaltransductiepaden van de meeste parasieten blijven niet gekarakteriseerd. Toekomstige opheldering kan het begrip van de ontwikkeling van parasieten verbeteren, met name signaalmolecuul-coderende genen in zandvlieg versus kweek en tussen promastigote vormen in de zandvlieg darm.

conclusies

Van transcriptome analyse is aangetoond dat het technisch werkzaam is om differentiële genexpressie in zandvlieg darm promastigote vormen te bestuderen. Transcript- en eiwitniveaus zijn niet goed gecorreleerd in deze organismen (ongeveer 25% kwantitatieve toevalligheden), vooral onder stresssituaties en differentiatieprocessen. Transcript- en proteïneniveaus gedragen zich echter in ongeveer 60% van de gevallen in kwalitatief opzicht (toename, afname of geen variatie) op vergelijkbare wijze. Veranderingen in translationele efficiëntie waargenomen in andere trypanosomatiden suggereren sterk dat de verschillen te wijten zijn aan translationele regulatie en regulatie van de steady-state eiwitniveaus. Het gebrek aan laag-input-monsterstrategieën maakt tot nu toe geen translatome en proteoom-analyse van van zandvlieg afgeleide promastigoten mogelijk.

Aanbeveling: Alcolea PJ, Alonso A, Molina R, Jiménez M, Myler PJ, Larraga V (2019) Functionele genomica in Leishmania- promastigoten met zandvlieg. PLoS Negl Trop Dis 13 (5): e0007288. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007288

Redacteur: Fabiano Oliveira, National Institutes of Health, VERENIGDE STATEN

Gepubliceerd: 9 mei 2019

Auteursrecht: © 2019 Alcolea et al. Dit is een open access-artikel dat wordt verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-licentie , die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie op elk medium toestaat, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en bron worden gecrediteerd.

Financiering: de auteurs danken de Ramón Areces Foundation voor een contract. De financiers hadden geen rol in onderzoeksontwerp, gegevensverzameling en -analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.

Concurrerende belangen: de auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Introductie: Waarom is het bestuderen van van zandvlieg afgeleide promastigotes belangrijk?

De Leishmania spp. (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) levenscyclus is digenetisch omdat twee gastheren betrokken zijn: een zoogdier en een zandvlieg (zijnde de geslachten Phlebotomus en Lutzomyia bewezen vectoren; Psychodidae: Phlebotominae). De promastigote is het beweeglijke stadium, dat zich ontwikkelt in het darmkanaal van de ongewervelde gastheer en wordt overgedragen aan de zoogdiergastheer tijdens bloedzuigen (herzien in [ 1 ]). Een klein deel van de geïnoculeerde promastigoten wordt geïnternaliseerd door mononucleaire fagocytische cellen [ 2 ] en onderscheidt zich tot het amastigotestadium, de ronde, niet-beweeglijke deelvorm (besproken in [ 3 , 4 ]). Uiteindelijk voedt een zandvlieg het bloed van een besmet zoogdier. Amastigoten worden vrijgegeven en omgezet in promastigoten, die beginnen aan het complexe ontwikkelingsproces in de darmen van het zandvliegje en steeds infectiever worden voor overdracht aan de zoogdiergastheer [ 5 ].

Bestuderen zand-fly afgeleide promastigoten niet vrij van moeilijkheden om drie redenen: ten eerste kan enkele parasieten worden geïsoleerd uit de insectendarm (ongeveer 2 x 10 5 van de gehele darm circa 10 4 promastigoten uit de stomodeal afsluiter [SV] gebied) [ 6 , 7 ] ten opzichte van kweken (2-4 x 10 7 promastigoten / ml) [ 810 ]; ten tweede zijn de promastigote populaties fenotypisch heterogeen en asynchroon in de zandvliegdarm [ 5 , 1114 ] en in de cultuur [ 15 ]; en ten derde, het onderhoud van zandvlieglaboratoriumkolonies, experimentele infectie en parasitaire isolatie van de darmen zijn niet vrijgesteld van technische problemen [ 16 , 17 ], omdat ze toegankelijk zijn voor gespecialiseerde laboratoria. Als gevolg hiervan wordt het meeste onderzoek naar de promastigotestadium uitgevoerd in axenische cultuur, en de moleculaire, biochemische en fysiologische kenmerken van deze fase zijn nauwelijks beschreven in zijn natuurlijke omgeving. Omdat de genoomsequenties van deze parasieten beschikbaar zijn [ 18 , 19 ], is een transcriptome analyse met hoge doorvoer van van zandvlieg afgeleide promastigoten uitgevoerd in L. infantum en later in L. majoor .

De belangrijkste promostigote vormen in de zandvlieg darm zijn procyclics, nectomonaden, leptomonaden en metacyclicen [ 14 , 20 ]. Deze vormen zijn ook gevonden in cultuur [ 21 ]. De belangrijkste metacyclische promastigote-isolatiemethode is gebaseerd op het verschillende agglutinatievermogen in aanwezigheid van het pinda-agglutinine (PNA), ondanks de structurele verschillen in het lipofosfoglycaan (LPG) [ 22 ]. Promastigote ontwikkeling in de zandvlieg darm werd uitgebreid besproken [ 14 , 20 , 23 ].

In-vitro-infectie van de menselijke myeloïde U937-cellijn met L. infantum promastigotes toonden aan dat de pinda-lectine-niet-agglutinerende metacyclische subpopulatie (LiPro-PNA ) infectiever is dan de agglutinerende subpopulatie (LiPro-PNA ) en de gehele populatie in de stationaire fase van de axenische kweek (LiPro-Stat), waaruit beide zijn geïsoleerd [ 24 ]. Dezelfde benadering heeft onthuld dat LiPro-Stat en LiPro-PNA minder infectieus zijn (respectievelijk ongeveer 50% en ongeveer 20% -30%) dan promastigoten geïsoleerd uit de zandvliegvector Phlebotomus perniciosus (LiPro-Pper) SV [ 7 , 25 , 26 ]. Zandvlieg-metacyclische stoffen zijn aanwezig in de nabijheid van SV, die zich in de borstkas middenvoor bevindt en een cruciale rol speelt bij de injectie van parasieten in de dermis van de zoogdiergastheer tijdens bloedmaaltijden. In het geval van de P. perniciosusL. infantum vector-parasiet paar, de metacyclische promastigote verhouding in kweek [ 24 , 25 ] en binnen de zandvlieg darm [ 27 ] is ongeveer gelijk (ongeveer 10%). De percentages zijn veel hoger (tot 90%) in andere parasiet- en vectorsoorten [ 28 , 29 ]. Cultuurpassage beïnvloedt ook de opbrengst in metacyclische promastigoten [ 28 ]. Daarom worden hogere besmettelijkheidsniveaus van zandvlieg afgeleide promastigoten geïsoleerd uit de SV verklaard door een meer geavanceerde differentiatiestatus (dwz deze promastigoten zijn meer “metacyclisch van aard”) in plaats van een eenvoudige verrijking in metacyclische groepen. Het werken met promastigoten vanuit het darmkanaal is technisch veeleisend, maar transcriptoomanalyse en infectie-experimenten geven aan dat het gebruik van het cultuurmodel niet altijd tot betrouwbare resultaten leidt. Besluitvorming per geval is noodzakelijk in het experimentele ontwerp [ 7 ].

Promastigote ontwikkeling in de zandvlieg darm

Volgens het model van Gossage en collega’s [ 14 ], gebaseerd op tijdsverloopstroomcytometrieanalyse, waren de Leishmania spp. levenscyclus is voltooid in drie delende fasen, die worden gescheiden door niet-overblijvende zendfasen. Eén daarvan is amastigote replicatie in fagocyste fagolysosomen van zoogdieren. Vervolgens vindt de bloedmaaltijdfase plaats in de buikholte middendarm. Deze fase bestaat uit procyclische promastigote replicatie gevolgd door differentiatie tot nectomonadpromastigoten. Dit is geldig voor suprapylariare soorten, die zijn gegroepeerd in het ondergeslacht Leishmania . Peripylarische soorten (subgenus Viannia ) beginnen met de ontwikkeling van de achterhand [ 30 ]. Nectomonaden zijn niet-drijvende vormen met een langwerpig flagellum die migreren naar de borstkas midgut. Tijdens de suikermaaltijdfase worden ze leptomonaden, die zich kunnen delen. Een paar leptomonad promastigoten differentiëren tot metacyclische promastigoten, die het zeer infectieuze stadium zijn ( Fig. 1A ). Andere vormen, zoals haptomonaden en paramastigoten, zijn gemeld. Deze terminologie is handig voor het begrijpen van ontwikkeling. Gossage en collega’s [ 14 ] benadrukken echter het belang van het vinden van moleculaire markers, wat kan helpen bij het preciezer definiëren van deze stadia. In Leishmania spp. Is de term “metacyclisch” gedefinieerd als de infectieuze vorm of het eindproduct van promastigote ontwikkeling binnen de zandvliegvector [ 31 ], een kleine snelzwemmende vorm met een langwerpig flagellum gedifferentieerd van leptomonaden [ 14 ]. Gossage en collega’s [ 14 ] benadrukten de afwezigheid van parasiet-zandvlieg interacties in axenische cultuur en waarschuwden voor onjuist gebruik van de termen procyclics en metacyclics wanneer geïdentificeerd met respectievelijk logaritmische en stationaire fase promastigotes.

thumbnail

Fig 1. Isolatie van metacyclische promastigoten uit de zandvlieg darm.

(A) Promastigote stadia tijdens ontwikkeling in de zandvlieg darm. Aangepast van [ 14 ] . (B) Locatie van metacyclische promastigoten in de voorpool van de PSG-promastigote plug in contact met de SV. Overgenomen van [ 7 ]. (C) In vitro infectiviteit van zandvlieg afgeleid L. infantum metacyclische promastigoten (Lipro-pper) in vergelijking met metacyclische promastigoten van cultuur (Lipro-PNA -) in de humane cellijn U937. Overgenomen van [ 25 ] . LiPro-PNA , L. infantum metacyclische promastigoten van kweek verkregen door de pinda agglutinine negatieve selectiemethode; LiPro-Pper, L. infantum metacyclische promastigoten uit de P. perniciosus stomodeal ventiel; PNA, pinda-agglutinine; PSG, promastigote secretorische gel; SV, stomodeal klep.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007288.g001

Bates [ 20 ] en Dostálová en Volf [ 23 ] evalueerden promastigote-sand fly-interacties tijdens de ontwikkeling en de hypothesen over de metacyclische promastigotes-transmissiemechanismen. Tijdens de bloedmaaltijdfase wordt bloed verteerd in de chitineuze peritrofe matrix (PM), terwijl ingebedde procyclische promastigoten prolifereren [ 32 ]. Vervolgens hopen nectomonaden zich op in het voorste deel van de matrix en kunnen ze ontsnappen [ 33 , 34 ] dankzij het chitinase dat wordt uitgescheiden door het darmepitheel [ 35 , 36 ]. Nectomonads kunnen naar voren migreren en zich stevig hechten aan de microvilli van het darmepitheel. Deze feiten dragen ertoe bij om uit te leggen waarom de zandvlieg een ware vector is omdat promastigoten niet worden uitgedreven tijdens defecatie en hun ontwikkelingsproces voortzetten. Een van de bevestigingsmechanismen in L. major binnen P. papatasi is de LPG-interactie met galactines van het darmepitheel. De aanwezigheid van LPG-receptoren in andere zandvliegsoorten blijft echter onduidelijk en er is melding gemaakt van een LPG-onafhankelijke ontwikkeling. In feite is de LPG-samenstelling variabel tussen de soorten. Het LPG, samen met bepaalde proteofosfoglycanen (PPG’s), kan ook een belangrijke rol spelen bij resistentie tegen proteolyse in de darm (besproken in [ 23 ]). Zodra nectomonaden de SV bereiken, worden ze leptomonaden en delen ze zich [ 14 ]. Leptomonaden produceren de promastigote secretorische gel (PSG) [ 37 ], voornamelijk samengesteld uit filamenteus PPG [ 38 ], waardoor ze ook enigszins aan het epitheel kunnen binden. Een klein deel van de leptomonaden wordt haptomonad promastigoten [ 39 ], die zich strak hechten aan het epitheel via hemidesmosome-achtige structuren [ 40 , 41 ], waarschijnlijk priming PSG-propvorming [ 20 ] en / of voorkeur voor verstopping [ 42 , 43 ], terwijl sommige andere differentiëren tot metacyclische promastigoten [ 37 ]. Dit proces wordt metacyclogenese genoemd en wordt gedefinieerd als de transformatie van slecht infectieuze tot zeer infectieuze promastigoten [ 28 , 44 ]. In de zandvlieg darm deduceren metacyclische promastigoten terug in leptomonad-achtige promastigoten, die retroleptomonad promastigoten worden genoemd, wanneer een tweede bloedmaaltijd wordt ingenomen door een geïnfecteerde zandvlieg. Interessant is dat retroleptomonad promastigoten snel differentiëren tot metacyclische promastigoten, wat een belangrijke toename van promastigoteaantallen en infectiviteit veroorzaakt [ 29 ]. Cultuurpassage veroorzaakt ook promedigote dedifferentiatie (zie “Het axenische kweekmodel: sterke en zwakke punten”).

Volgens de hypothese met geblokkeerde vliegen blokkeert de PSG-plug de SV totdat deze wordt verwijderd door regurgitatie tijdens bloedinname [ 45 ]. Leptomonaden zijn ingebed en de meeste metacyclische cellen bevinden zich in de stekkerpolen [ 20 ]. Een andere hypothese is passieve inoculatie van alleen promastigotes in de proboscis [ 4648 ]. Beide hypothesen sluiten elkaar niet uit, omdat beide mechanismen aan de transmissie kunnen deelnemen [ 20 ]. In feite zijn lage dosis en hoge dosis bijtpatronen waargenomen en kunnen deze correleren met de respectieve bovengenoemde transmissiemechanismen [ 49 ]. Daarnaast werd chitinase-gemedieerde schade waargenomen in de SV [ 33 ], wat de hypothese van regurgitatie ondersteunt. De faryngeale en cibariale pompen zouden bijdragen aan het proces [ 42 , 43 ]. PSG-hoge oplosbaarheid verklaart waarom een ​​paar metacyclische promastigoten worden vrijgegeven van de PSG-stekkerpaal wanneer deze in contact komt met bloed dat wordt ingenomen (herzien in [ 50 ]). PSG- en zandvliegspeeksel-egestie die metacyclische promastigoten vergezellen, spelen waarschijnlijk een rol bij de initiële infectiestappen [ 51 ], inclusief immuunresponsmodulatie [ 5254 ].

De fenotypische kenmerken van de verschillende promastigote vormen in de zandvlieg darm verschillen tussen soorten. Het afzonderlijk bestuderen van elke vorm is een uitdaging. Het bindvermogen is bijvoorbeeld strikt stadiumafhankelijk, aangezien nectomonaden en leptomonaden aanzienlijk gebonden zijn aan het epitheel volgens de verschillende mechanismen die hierboven zijn genoemd en verder worden uitgelegd in de volgende sectie, terwijl procyclische en metacyclische vormen niet-bindende vormen zijn. Niettemin is het relatieve bindingsvermogen variabel tussen verschillende soorten en in bepaalde gevallen is een milde bindingsneiging waargenomen in procyclics en metacyclics. Nectomonaden binden bijvoorbeeld strakker dan leptomonaden in L. infantum , terwijl er geen wezenlijke verschillen zijn waargenomen in het geval van Leishmania mexicana en niet zoals in L. infantum , L. mexicana metacyclics binden iets strakker dan procyclics [ 55 ].

Zandvlieg- Leishmania- interacties

Weinig moleculaire interacties tussen Leishmania spp. en de darmen van het zand zijn onthuld [ 23 ]. De aangeboren immuunrespons op pathogenen is uitgebreid onderzocht in insecten, waaronder receptoren, signaalroutes en effectoren (antimicrobiële peptiden, reactieve zuurstofspecies [ROS], autofagie, enz.) [ 5660 ]. Defensines, een caspar-achtig eiwit en ROS werden geassocieerd met aangeboren immuniteit van de zandvlieg tegen Leishmania spp. [ 23 , 6165 ]. Midgut transcriptomische analyse in Lutzomyia longipalpis , P. papatasi , en P. perniciosus [ 6669 ] onthulde belangrijke gegevens over moleculen die mogelijk een interactie aangaan met Leishmania spp. moleculen.

De bloedmaaltijd induceert spijsverteringsenzymen (fundamenteel, trypsinen en chymotrypsinen). Dit zijn serineproteasen [ 6672 ] zoals andere enzymen die op het transcriptniveau in de middendarm worden geïnduceerd, zoals een alanyl-aminopeptidase (een nieuw serineprotease), astacineachtige metalloproteasen en metallocarboxypeptidasen [ 73 ]. Resistentie tegen proteasen is variabel, afhankelijk van de Leishmania- soort. Deze functie is cruciaal voor vectorcompetentie, waarbij compatibele en niet-compatibele vectoren worden gedefinieerd met een bepaalde Leishmania- soort [ 7476 ]. Ten minste de helft van de amastigotenpopulatie die transformeert in onvolwassen promastigoten tijdens de eerste uren van darmkolonisatie worden gedood, zelfs in compatibele soorten [ 37 ]. In de vroege ontwikkelingsstadia is de parasiet in staat om proteaseactiviteitsniveaus en timing [ 66 , 72 , 7780 ] te regelen door genexpressiemodulatie en productie van serineproteaseremmers (ISP’s) in de zandvliegmedio wanneer de vector compatibel is. De L. belangrijk genoom codeert voor ISP’s die geen doelwitten hebben in het proteoom van de parasiet [ 18 ] maar waarvan is aangetoond dat het actief is tegen de proteasen van zoogdierlijke gastfagocyten [ 81 ] en trypsine-activiteit uit zandvliegdarmen [ 82 ]. Amastigoten en metacyclische promastigoten zijn resistent tegen zandvlieg-darmproteasen maar niet procyclische promastigoten – namelijk in de eerste 2-8 uur van een amastigote-naar-promastigote overgang [ 83 ]. Fosfoglycanen (PG’s) en het uitgescheiden zuurfosfatase (SAP) zijn essentieel voor resistentie [ 31 ]. LPG fungeert bijvoorbeeld als een schild tegen proteolytische activiteiten.

De PM is samengesteld uit peritrofinen, die een of meer chitine-bindende domeinen (CBD’s) bevatten, die in de meeste gevallen zijn voorspeld [ 66 , 67 , 69 ]. Meerdere CBD-peritrofinen verbinden waarschijnlijk PM chitine-fibrillen. PM-formatie is een extrinsiek beschermingsmechanisme voor promastigoten tijdens de digestie van bloedmeel [ 83 , 84 ]. De zandvlieg-middendarm reguleert transcriptioneel peritrofinen in de aanwezigheid van promastigoten [ 66 , 67 ]. De PM begint ongeveer 2 dagen na inname te desintegreren. Een noodzakelijke maar niet voldoende voorwaarde voor succesvolle promastigote ontwikkeling binnen de zandvlieg darm is PM breuk waardoor nectomonaat promastigote-afgifte mogelijk wordt. Dit is niet altijd mogelijk, afhankelijk van parasieten en vectorsoorten, en de implicatie van chitinase door parasieten is controversieel [ 33 , 66 , 67 , 8588 ]. Hemoglobine remt Leishmania spp. chitinase. Om deze reden is de parasiet niet in staat om aan de PM te ontsnappen totdat bloed is verteerd [ 89 ]. Chitinasen van een bepaalde Leishmania- soort zijn echter niet in staat om de PM van alle soorten zandvlieg-vector te verbreken en niet te ontsnappen aan de PM leidt tot parasitaire eliminatie door defecatie. Daarom draagt ​​dit mechanisme bij aan de parasiet-vectorcompetentie [ 86 ].

Zodra nectomonaden uit de PM ontsnappen, is gehechtheid aan het darmepitheel vereist om klaring te voorkomen en vervolgens geleidelijk op te stijgen door de hele darm. Het is aangetoond dat prometigoten van nectomonaden en leptomonaden zich specifiek hechten aan de darmvliesvilli en het mechanisme is afhankelijk van het paar van parasieten en vectoren [ 55 , 90 ]. Een molecuul dat betrokken is bij gehechtheid is de Leishmania spp. FLAG1 / SMP1-flagellar eiwit [ 91 ]. Volgens deze interacties zijn zandvliegvectoren geclassificeerd als beperkend, wat betekent dat ze compatibel zijn met één of enkele Leishmania- soorten en tolerant zijn, wat betekent dat ze ontwikkeling van meerdere Leishmania- soorten ondersteunen [ 9294 ]. De meest bestudeerde interactie tussen parasiet en zandvlieg is het soort- en stamspecifieke Leishmania LPG-zandvliegmedicijnbevestigingsmechanisme voor middendarm [ 95 , 96 ]. Deze interactie is alleen in de L aangetoond. belangrijkste Friedlin V1 strain- P. papatasi of P. duboscqi- paren, maar andere L. grote stammen kunnen niet binden. Het LPG is samengesteld uit een glycosylfosfatidylinositol (GPI) anker en een glycaan backbone samengesteld uit PG-eenheden en bevestigd aan het anker door een hexasaccharidekern [ 97 ]. De samenstelling van de zijketens varieert afhankelijk van de soort en soort [ 98 ]. Monogalactosylatie is het optimale patroon voor herkenning van galectine, aangetoond door middel van geconstrueerde leishmania-donovani- lijnen die zijn geoptimaliseerd voor galactosylatiepatroon [ 99 ]. De samenstelling van de LPG-zijketens is ook afhankelijk van de fase. Arabinose-residuen zijn galactose-residuen van de zijkanten van de dop in L. major , waardoor promastigote-afgifte van galectines mogelijk is [ 98 ]. Alternatieve interactiemechanismen blijven onontdekt. Galectinen zijn afwezig in de middendarm van tolerante soorten zoals L. longipalpis en P. perniciosus [ 66 ], die overleving van LPG-deficiëntie L mogelijk maken . major en L. mexicana promastigotes in hun lef op een LPG-onafhankelijke manier [ 23 , 45 ]. Dit is echter controversieel omdat andere auteurs rapporteerden dat de LPG-samenstelling Leishmania spp. competentie in verschillende vectoren [ 100 ]. Deze verklaring de hypothese was alleen geldig in specifieke vectoren [ 101 ]. Hoewel er op LPG gebaseerde mechanisme voor het loslaten van hechtingen in verschillende Leishmania em> spp.-sand-vliegparen is gerapporteerd, zijn de receptoren nog niet geïdentificeerd (zie de volgende sectie). Samenvattend is het bekend dat verschillende mechanismen de hechting van nectomonas promastigoten aan de microvilli van het microvee van de zandvliegen mediëren, maar de meeste blijven ongekarakteriseerd, en er is controverse over de rollen van LPG in verschillende parasietsoorten. P>

Tot slot kunnen de condities van de zandvlieg darm bijdragen aan promastigote differentiatie. Een zure omgeving, nutriëntuitputting en waarschijnlijk schaars tetrahydrobiopterinegehalte induceren metacyclogenese. In dit proces zijn endosome-sortering en autofagie essentieel [ 102 ], evenals verschillende L em>. major em> eiwitten met onbekende functie gecodeerd in het HASP / SHERP-gencluster (hydrofiele zure oppervlakte-eiwitten en kleine hydrofiele endoplasmatische reticulum-eiwitten) [ 103 a >]. p> Div>

De axenische cultuur model: Sterke punten en beperkingen h2>

De eerste axenische cultuur van Leishmania em> parasieten werden uitgevoerd door Nicolle in het Nicolle-Novy-McNeal-medium [ 104 ]. Sindsdien is een toenemend aantal kweekmedia ontwikkeld, wat heeft geleid tot eenvoudige, snelle en zeer productieve promastigote culturen. Met betrekking tot celcyclus en differentiatie zijn promastigote populaties in de axenische cultuur, zoals in de zandvlieg darm, complex en asynchroon. Er wordt aangenomen dat ontwikkeling in de zandvliegdarm wordt nagebootst in axenische kweek bij 26-27 ° C in niet-gedefinieerde media die door hitte geïnactiveerd zoogdierserum bevatten [ 105 110 ]. Promastigoten in de stationaire fase zijn infectieus ondanks de afwezigheid van parasiet-zandvlieg interacties. Gecultiveerde promastigoten zijn echter minder infectieus dan metacyclische promastigoten die uit de zandvlieg darm worden verkregen, tenminste in L em>. infantum em> en L em>. major em> [ 7 , 25 , 111 ]. In feite wordt de infectiviteit verzwakt naarmate het aantal kweekpassages toeneemt. Om deze reden zijn doorgangen door proefdieren vereist (te zien in [ 109 ]). Deze observaties benadrukken het belang van de promastigote-zandvlieg interacties en suggereren dat aanpassing aan de kweekomstandigheden resulteert in een progressief verlies van de infectieuze eigenschappen. Net als in de zandvlieg zijn promastigote populaties heterogeen in cultuur en is slechts een klein deel metacyclisch. De meest wijdverbreide en succesvolle methode om subpopulaties van metacyclische promastigoten uit kweken te isoleren, is gebaseerd op agglutinatie met LPG in de aanwezigheid van de PNA. Tijdens de metacyclogenese wordt het LPG gemodificeerd, wat leidt tot verlies van agglutinatievermogen in de aanwezigheid van PNA [ 22 ]. De modificaties bestaan ​​uit het toevoegen van α-D-arabinopyranose-residuen aan de β1,3-D-galactose-residu (βGal) zijketens [ 112 , 113 ]. Daarom is de metacyclische selectiemethode PNA negatief. De agglutinerende (PNA sup>) subpopulatie is minder infectieus dan de niet-agglomererende (PNA – sup>) subpopulatie in L em>. major em> en L em>. infantum em> [ 22 , 24 ]. De LPG-structuur in L em>. infantum em> [ 114 ], inclusief L em>. infantum chagasi em> [ 115 ], is anders en varieert afhankelijk van de stam, inclusief zijketens bestaande uit glucosemonomeren of oligomeren [ 114 ]. De LPG van een Soedanees L em>. donovani em> stamagglutinaat in vroege differentiatiestadia wanneer deze in contact komen met PNA [ 113 , 116 , 117 ], maar metacyclische vormen falen om te agglutineren [ 24 , 113 , 117 119 ]. L em>. infantum em> PNA – sup> promastigoten zijn infectiever dan PNA sup> promastigotes [ 24 a >] en de gehele stationaire fase populatie [ 25 ], wat suggereert dat de LPG deelneemt aan alternatieve bevestigingsmechanismen. Soares en collega’s [ 115 ] rapporteerden een L em>. infantum em> LPG- L em>. longipalpis em> middendarmepitheelinteractie op basis van PG-receptoren. De interactie is gebaseerd op β1,3-glucosylatie en afgifte wordt veroorzaakt door verwijdering van glucoseresiduen. Hetzelfde mechanisme werd eerder beschreven voor een Indiase L em>. donovani em> -stam en de vector P em>. argentipes em> [ 117 ]. Om meer complexiteit toe te voegen, is het mechanisme tegenovergesteld in Leishmania braziliensis em> omdat toevoeging van glucoseresiduen leidt tot ex vivo loslaten van L em>. longipalpis em> darmexplantaten [ 120 ]. Samenvattend verschillen de interactie- en afgiftemechanismen van LPG-gut tussen soorten en zijn niet gerelateerd aan op PNA gebaseerde scheiding van procyclische en metacyclische verbindingen. De minimale agglutinerende hoeveelheid PNA is variabel tussen L em>. infantum em> -stammen vanaf 50 μg / ml [ 24 , 118 ]. De verschillende LPG-samenstelling in de bovengenoemde soort verklaart deze waarnemingen. Interessant is dat de vormen van PNA – sup> en PNA sup> kunnen worden geïsoleerd in het monogenetische trypanosomatide Crithidia fasciculata ​​em> [ 121 ], maar de implicaties voor het begrip van de levenscyclus zijn onbekend. P>

In vitro infectie-experimenten van de menselijke myeloïde U937 cellijn met L em>. infantum em> promastigotes hebben aangetoond dat de LiPro-PNA – sup> metacyclische subpopulatie infectiever is dan het agglutinerende LiPro-PNA sup> en de hele populatie in de stationaire fase van axenische cultuur (LiPro-Stat), waaruit beide geïsoleerd zijn [ 24 ]. Dezelfde benadering heeft onthuld dat LiPro-Stat en LiPro-PNA – sup> minder infectieus zijn (respectievelijk ongeveer 50% en ongeveer 20% -30%) dan promastigoten die zijn geïsoleerd uit de SV van de zandvliegvector P em>. perniciosus em> (LiPro-Pper) [ 7 , 25 a >, 26 ]. Zandvlieg-metacycli worden gevonden in de nabijheid van SV. In het geval van de P em>. perniciosus em> – L em>. infantum em> vectorparasietpaar, het aandeel metacyclische promastigoten in kweek [ 24 , 25 ] en binnen de sand-fly gut [ 27 ] is ongeveer gelijk (ongeveer 10%). De percentages zijn veel hoger (tot 90%) in andere parasiet- en vectorsoorten [ 28 , 29 ]. Cultuurpassage beïnvloedt ook de opbrengst in metacyclische promastigoten [ 28 ]. Daarom worden hogere infectiviteitsniveaus van zandvlieg-afgeleide promastigoten geïsoleerd uit de SV verklaard door een geavanceerdere differentiatiestatus (d.w.z. deze promastigoten zijn meer “metacyclisch van aard”) in plaats van een eenvoudige verrijking in metacyclische groepen. P>

Als je bedenkt hoe uitdagend het werken met promastigoten uit het darmkanaal is, kan de kosten-batenverhouding vermoedelijk kantelen voor axenische cultuur in principe, maar dit is niet zo duidelijk wanneer we resultaten bekijken die verkregen zijn door middel van transcriptoomanalyse. Alternatieve methoden voor de isolatie van metacyclische promastigoten, zoals centrifugatie in Percoll-gradiënt, zijn beschreven, die buiten de scope van deze review vallen. P> Div>

Transcriptoomanalyse van promootigotes die zijn afgeleid van zandvliegen: technische overwegingen en actuele datasets h2>

Microarrays zijn dichte moleculaire probematrixen op een vast oppervlak. DNA-microarrays bevatten duizenden genen, genfragmenten en / of niet-coderende sequenties die zijn gehybridiseerd met een of meer gemerkte nucleïnezuurmonsters (DNA, cDNA of RNA) voor verschillende doeleinden, zoals genexpressieprofilering. In dit geval worden de totale RNA- of mRNA-monsters direct gemerkt, geamplificeerd en gemerkt, of omgekeerd getranscribeerd om direct of indirect gemerkt cDNA te verkrijgen. De fluorescerende labels maken het mogelijk de relatieve niveaus van elke doelsequentie te meten zodra emissiesignalen zijn verkregen met een gespecialiseerde scanner ( Fig 2 ). Bioinformatica analyse is relatief eenvoudig omdat sondes meestal van tevoren worden geïdentificeerd en er zijn slechts twee basisstappen vereist: normalisatie en statistische analyse van differentiële genexpressie (DGE). Meer technische details over microarray-analyse zijn te vinden in beoordelingen door Mantione en collega’s [ 62 ] en Lowe en collega’s [ 63 ]. Een beoordeling van de invloed van de DNA-microarraytechnologie in Leishmania em> onderzoek is ook beschikbaar [ 65 ]. P>

 thumbnail img> div>

Fig 2. span> Strategieën voor DGE-analyse van zandvlieg-afgeleide promastigotes . p>

Alleen transcriptomische strategieën zijn tot nu toe mogelijk voor DGE-analyse voor monsters met een zeer lage invoer, zoals van zandvlieg afgeleide promastigoten. In slRNA-seq-strategieën wordt de SL-sequentie gebruikt in cDNA-synthese van de tweede streng (#), waardoor de specificiteit toeneemt bij het analyseren van monsters die genetisch materiaal van de gastheer bevatten. Een cross-hybridisatiecontrole moet worden opgenomen in microarray-experimenten om beïnvloede resultaten te voorkomen als gevolg van ruis van het genetisch materiaal van de gastheer. De RNA-seq-strategieën maken gemultiplexte analyse mogelijk door indexeringssequenties tijdens PCR-amplificatie (†) te omvatten. Mapping to genome en alignment to transcript annotations is alleen nodig tijdens microarray-hybridisatie-experimenten als de DNA-sondes die op de dia’s zijn gespot niet vóór het experiment zijn geïdentificeerd (*). Een voorbeeld is shotgun genoom DNA microarrays, waarin alleen de klonen van belang die DEGs bevatten, worden gesequenced en uitgelijnd om die genen te identificeren [ 24 ]. aRNA, geamplificeerd RNA; Cy3, cyanine 3; Cy5, cyanine 5; DEG, differentieel tot expressie gebracht gen; DGE, differentiële genexpressie; IVT, in vitro transcriptie; NGS, Next Generation Sequencing; RNA-seq, RNA-sequencing; SL, gesplitste leadersequentie; slRNA-seq, RNA-sequentiebepaling op gesplitste leader. p>

              https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007288.g002 p> div>

RNA-sequencing (RNA-seq) is een high-throughput benadering gebaseerd op Next Generation Sequencing (NGS) die bestaat uit amplificatie op genoomschaal en NGS van korte cDNA-fragmenten gegenereerd uit RNA-monsters. Voor dit doel wordt dubbelstrengs cDNA gegenereerd en PCR-geamplificeerd, waarin geschikte linkers voor NGS zijn opgenomen. De in alle stappen gebruikte primers en de PCR-condities zijn ontworpen volgens het gewenste fragmentgroottebereik, dat typisch tussen 0,1 en 1 Kbp ligt. De producten zijn gefragmenteerd en onderworpen aan NGS in elk van de commercieel verkrijgbare platforms (464-pyrosequentiebepaling, Illumina, Ion Torrent, etc.) ( Fig 2 ). Als alternatief kan gefragmenteerd RNA worden gebruikt als de invoer in het protocol voor de bereiding van de bibliotheek. Bioinformatica-analyse is complex omdat leeswaarden tot 300 bp [ 122 ] moeten worden toegewezen aan de genoomsequentie, waarvoor veeleisende vaardigheden vereist zijn. Verdere informatie over technische details is beoordeeld door Mantione en collega’s [ 62 ] en Lowe en collega’s [ 63 ]. p>

Tegenwoordig is transcriptoomanalyse een routinematige technische aanpak dankzij de ontwikkeling van de DNA-microarraytechnologie tijdens het midden van de jaren negentig, die de afgelopen twee decennia op grote schaal is gebruikt en wordt vervangen door RNA-seq. Op dit punt is het belangrijk op te merken dat de voorwaarde voor een technische benadering geldig is, eerder betrouwbaarheid dan nieuwheid. Zowel DNA-microarray-hybridisatieanalyse als RNA-seq zijn betrouwbaar voor genexpressieprofilering of DGE-analyse, hoewel RNA-seq een krachtigere en robuustere benadering is [ 123 , 124 ]. Microarrays en RNA-seq zijn technisch reproduceerbaar (> 99%) en nauwkeurige (ongeveer 90%) benaderingen met hoge doorvoer. Beide kunnen splice-varianten detecteren. RNA-seq vereist echter veel minder input van de hoeveelheid RNA-monsters om dezelfde dekking van het genoom te bereiken, is ongeveer 1.000 keer gevoeliger en wordt gekenmerkt door lagere achtergrondniveaus en een dynamisch bereik dat ongeveer 100-1000 keer hoger is. Bovendien is RNA-seq geschikt voor SNP-detectie en UTR-analyse en vereist niet noodzakelijkerwijs een referentiegenoomsequentie [ 67 , 123 , 124 ]. P>

Voordat een DGE-analyse wordt uitgevoerd, moeten biologische monsters worden onderzocht om te bepalen of ze geschikt zijn om de voorgestelde hypothese aan te pakken. De belangrijkste kenmerken van metacyclische promastigoten zijn bijvoorbeeld hoge infectiviteit en morfologie (fusiform, klein formaat, met een langwerpig flagellum). Daarom kunnen metacyclische promastigoten worden geïdentificeerd voor stroomafwaartse DGE door infectie-experimenten ( Fig. 1B en 1C ) [ 7 , 25 , 26 ] of morfologische kenmerken [ 125 ]. Promastigotes differentiëren eenmaal geïsoleerd omdat ze niet-bestaande vormen zijn [ 14 ]. In feite zijn Leishmania em> spp. is aangepast om zeer snel te reageren op verschillende omgevingen [ 126 ]. Gezien het vervangingsprincipe, kan experimenteren met dieren worden vervangen door in vitro infectie van gevestigde myeloïde cellijnen. Gezien het schaars aantal promastigoten dat van elke zandvlieg wordt verkregen, moet elk monster bestaan ​​uit een mengsel van promastigoten van verschillende zandvliegen. Een fractie van het monster moet onmiddellijk worden verwerkt voor RNA-isolatie na extractie uit de darm (bijv. Gelyseerd in Trizol-reagens) en de resterende fractie zo snel mogelijk worden gebruikt voor het infectie-experiment [ 7 , 25 , 26 ]. In tegenstelling tot RNA-seq, dat altijd een PCR-amplificatiestap bevat, is DGE op basis van de DNA-microarraytechnologie niet geschikt voor samples met een zeer lage input, tenzij RNA wordt geamplificeerd. Dankzij RNA-amplificatie was slechts 20 ng LiPro-Pper totaal RNA per replicaatmonster voldoende om transcriptoomvergelijkingen uit te voeren met intracellulaire amastigoten, promovendi in de stationaire fase en PNA – sup> promastigoten met microarrayanalyse [ 7 , 25 , 26 ]. Betrouwbaarheid van microarrayresultaten wordt niet aangetast door RNA-amplificatie, zoals anders wordt gesuggereerd in [ 125 ]. De betrouwbaarheid is zelfs verbeterd, ongeacht of dit nodig is voor het uitbreiden van het monster [ 127 129 ]. De amplificatieprocedure bestaat uit dubbelstrengs cDNA-synthese uitgaande van een poly (T) -oligonucleotide waarin de T7-promotorsequentie stroomopwaarts is opgenomen, gevolgd door lineaire amplificatie door middel van in vitro transcriptie (IVT) met het T7-RNA-polymerase, waarbij reverse complement-RNA-moleculen worden verkregen. klaar voor synthese van gemerkt cDNA en daaropvolgende hybridisatie met shotgun- of oligonucleotide-DNA-microarrays. De bereiding van RNA-seq-bibliotheken vereist ook synthese van dubbelstrengs cDNA en amplificatie en de L em>. belangrijkste em> RNA-invoer was 5-20 ng [ 125 ]. Het fundamentele conceptuele verschil is afhankelijk van PCR in plaats van IVT voor vereiste amplificatie voor daaropvolgende verwerking door high-throughput-sequencing respectievelijk gelabelde cDNA-synthese en hybridisatie ( Fig 2 ). Primerontwerp wordt uitgevoerd volgens elk high-throughput sequentiebepalingsplatform (bijvoorbeeld Illumina-adapters en sequentiebepalingsprimers). Bovendien kunnen indexsequenties worden toegevoegd voor gemultiplexte sequencing. RNA-seq data-analyse vereist aanzienlijk meer bioinformatica vaardigheden en computerbronnen dan microarray-analyse doet [ 123 ]. P>

De aanwezigheid van weefsel van de zandvlieggastheer moet tot een minimum worden beperkt bij het isoleren van het biologische monster. Microarray kruislingse hybridisatiecontroles werden uitgevoerd om specifieke hybridisatieomstandigheden te selecteren en de enkele kruishybridiserende vlekken gevonden bij analyse [ 7 , 25 , 26 ]. Specifieke sequentie-uitlijning tegen de genoomsequentie van de parasiet zou vermoedelijk de meeste ruis van zandvliegsequenties verwijderen, maar het kan interfereren in kwantificatie van geconserveerde sequenties. Gesplitst leider RNA-seq (slRNA-seq) is een snelle, eenvoudige en selectieve methode die dit ongemak overwint zonder de resultaten voor te stellen die anders zouden worden verkregen met een reguliere RNA-seq-procedure [ 130 , 131 ]. slRNA-seq maakt lage invoerhoeveelheden van L em> mogelijk. donovani em> RNA (1 ng) monsters ingebed in een hoeveelheid menselijk RNA die 1.000 keer groter is, hoewel deze monsters dieper moeten worden gesequenced om dezelfde dekking te bereiken als zuivere Leishmania em> spp. RNA [ 130 ]. Zodra de analyse is voltooid, kan validatie van bepaalde resultaten door kwantitatieve PCR (qPCR) of Northern-blot handig zijn. Zelfs wanneer de transcriptniveaus gevalideerd zijn, correleren ze in ongeveer 75% van de gevallen niet kwantitatief met de eiwitniveaus [ 132 ]. Helaas is transcriptoomanalyse tot nu toe de enige haalbare omicsbenadering voor tot zandvlieg afgeleide promastigoten vanwege de monsterhoeveelheidseisen voor translatome en proteoomanalyse (zie de sectie ‘Translatome en proteoomanalyse: een grote uitdaging’). Het aantal kwalitatieve RNA-eiwitniveau-toevalligheden (opwaartse regulatie, neerwaartse regulatie en constante expressie op beide niveaus) in Lahav en collega’s ‘[ 132 ] datasets is ongeveer 60%. Dit suggereert dat ten minste een derde van de veranderingen in transcriptniveaus niet in eiwitniveaus zal worden weerspiegeld. Groepen van functioneel gerelateerde genen die variatie op transcriptniveau in dezelfde zin laten zien (opwaartse regulering of neerwaartse regulatie) in het biologische proces dat wordt bestudeerd, zullen waarschijnlijker worden weerspiegeld op het eiwitniveau. Dit is ook variabel, afhankelijk van de geanalyseerde levenscyclusstadia. Lagere RNA-eiwitcorrelatie is bijvoorbeeld waargenomen in organismen onder stresssituaties (fundamenteel, de differentiatieprocessen van procyclics naar metacyclics en metacyclics naar amastigoten) (gereviewed in [ 133 ]). mRNA-veranderingen die niet gecorreleerd zijn met eiwitniveaus kunnen ook belangrijk zijn voor de regulatie van steady-state transcriptniveaus. Rijp RNA kan onmiddellijk worden gebruikt voor eiwitsynthese of worden gestabiliseerd en voor onbepaalde tijd translationeel inactief worden gehouden (te zien in [ 134 ]). Modulatie van translationele efficiëntie is een extra mechanisme voor genexpressie-regulering [ 135 ]. P>

Vier DGE-analyses van L em>. infantum em> promastigoten verkregen van experimenteel geïnfecteerde P em>. perniciosus em> binnen de vector [ 7 , 25 , 26 , 69 ] en een van L em>. major em> van P em>. duboscqi em> [ 125 ] zijn uitgevoerd ( Tabel 1 a >). Een slRNA-seq analyse van heterogene populaties is ook gepubliceerd [ 69 ]. De resultaten van deze onderzoeken zijn fundamenteel aanzienlijk verschillend omdat de vergelijkingen niet gelijkwaardig zijn. Eerst L em>. infantum em> is verantwoordelijk voor zoonotische viscerale leishmaniasis in het Middellandse-Zeegebied en Zuid-Amerika, terwijl L em>. major em> is verantwoordelijk voor cutane leishmaniasis in de Oude Wereld. Hun verschillende affiniteit voor zandvlieg-vectorsoorten en bij belangrijke ontwikkelingsprocessen (bijvoorbeeld hechting van nectomonaden aan het darmepitheel, zie hierboven) is een waarschijnlijke oorzaak voor het verkrijgen van niet-passende DGE. Ten tweede zijn de meeste voorbeelden en vergelijkingen niet gelijkwaardig. Bijvoorbeeld intracellulair L em>. infantum em> amastigoten die in vitro zijn verkregen uit de myeloïde humane U937-cellijn [ 26 ] zijn niet gelijk aan intracellulair L em>. belangrijkste em> amastigoten verkregen uit footpathlaesies van muizen (LmAM) [ 125 ]. Zoals te verwachten was, was het aantal ≥2-voudig differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) 2,4 maal groter in de laatste, waar meer complexe biologische monsters niet alleen de parasiet en de gastheercel zelf vertegenwoordigden, maar ook de complexe interacties met andere immunologische componenten. In beide gevallen werden DEG-gegevens aangeduid als L em>. infantum em> (LiPro-Pper) en L em>. major em> zandvlieg metacyclische promastigoten (LmSFMP). In het eerste geval [ 26 ] werden ze geïsoleerd van de voorste pool van de PSG-stekker in contact met de SV, omdat deze locatie is verrijkt met metacycli, en hun infectiviteit werd gecontroleerd met behulp van het in vitro-infectiemodel (zie hierboven). Haptomonad promastigoten zijn ook aanwezig in elk overblijvend materiaal overgedragen van de SV-structuur ( Fig. 1B ). In het tweede geval werden procyclische, nectomonaden en metacyclische verbindingen geïsoleerd uit verschillende ingewanden en afzonderlijk verwerkt, aannemende dat de populaties na respectievelijk 2, 4 en 15 dagen ontwikkeling homogeen waren. De hele ingewanden werden gemacereerd, promastigote populaties werden gekwantificeerd met een hemocytometer en de morfologie werd onderzocht. Alleen monsters die een homogeniteit van> 90% hadden moeten hebben, werden voor analyse meegenomen [ 125 ]. Echter, het persen van hele ingewanden garandeert niet noodzakelijkerwijs homogeniteit van populaties, zelfs wanneer de timing wordt uitgebreid, omdat verschillende parasietvormen altijd in de darm blijven. Killick-Kendrick en collega’s [ 27 ] vonden bijvoorbeeld niet meer dan 10% van L em>. infantum em> metacyclics in de P em>. perniciosus em> darm zelfs 8-15 dagen na bloedvoeding van geïnfecteerde honden. Zoals hierboven vermeld, is dit afhankelijk van het parasiet-vector-paar. Samenvattend, alle populaties geanalyseerd in de studies vermeld in Tabel 1 zijn homogeen, met uitzondering van de studie die heterogene populaties expres vergelijkt [ 69 ]; maar complete monsterhomogeniteit is tegenwoordig onmogelijk te bereiken. Een alternatieve analysestrategie is single-cell genomics. Helaas zijn moleculaire markers niet beschikbaar voor metacyclische promastigoten, die het resultaat zijn van metacyclogenese. HASP en SHERP zijn markeringen van metacyclogenese (d.w.z. zij worden niet alleen in metacyclische promastigoten tot expressie gebracht, maar ook in tussenstadia) in L em>. major em> [ 103 ]. Om deze redenen vergelijkingen van LiPro-Stat met LiPro-Pper en LiPro-PNA – sup> met LiPro-Pper [ 7 , 25

] zijn niet gelijk aan vergelijkingen van LmSFMP met procyclics voor zandvliegen (LmSFPP) [ 125 a >] of cultuurmetacyclische (LmCMP) versus logfase promastigotes (LmPro-Log) [ 136 ]. Aminozuurtransporters aATP11 werden bijvoorbeeld opwaarts gereguleerd in LmSFMP versus LmSFPP en in nectomonademailastigoten (LmSFNP) versus LmSFPP [ 125 ], maar het werd niet waargenomen in LiPro-Pper versus LiPro-Stat, mogelijk omdat LiPro-Stat-populaties nectomonad-, leptomonad- en metacyclische vormen kunnen bevatten [ 21 ]. Consequent werd geen aATP11 differentieel gereguleerd bij het vergelijken van LiPro-Pper en LiPro-Stat ofwel [ 25 ]. Niet alleen is het experimentele ontwerp verschillend om verschillende biologische vragen te beantwoorden, maar ook de parasiet-vectormodellen zijn in veel gevallen verschillend. Zo is tot dusverre slechts één soort van promastigote-sand gut-interactie bekend, het LPG-galectinebindingsmechanisme, dat alleen wordt aangetoond in de L em>. belangrijkste em> – P em>. papatasi em> en L em>. belangrijkste em> – P em>. duboscqi em> paren (beoordeeld in [ 23 ]). Een ander voorbeeld is de darmmicrobiota, waarvan is aangetoond dat ze promastigotendifferentiatie begunstigt in L em>. longipalpis em> [ 137 ] maar kan bij andere soorten zandvliegen anders zijn. Samengevat, generalisatie van Leishmania em> -zandvliegmodellen moet voorzichtig per geval worden overwogen en bij het vergelijken van DGE-onderzoeken moet rekening worden gehouden met verschillende experimentele instellingen. Een voorbeeld van correcte generalisatie is de HASP / SHERP-cluster, gp63 en autofagie-genen in L em>. major em> en L em>. infantum em> (zie volgende gedeelte). p>

De vergelijking tussen verschillende experimenten van LmSFMP / LmSFPP en LmCMP / LmPro-Log [ 125 ] is waarschijnlijk robuust, zelfs als het technische RNA -seq benadering is niet precies hetzelfde, zoals ondersteund door de methodologische studie over meta-analyse van RNA-seq expressie data door Sudmant en collega’s [ 138 ]. Er werd beweerd dat slechts 26o tussen beide datasets verschilden, maar in feite is het aantal genen dat differentieel tot ≥2 maal is uitgedrukt op een statistisch significantieniveau α = 0,05 398 in LmSFMP / LmSFPP [ 125 ] en slechts 108 in het geval van LmCMP / LmPro-Log [ 136 ], waarvan 72 niet samenvallen. In het geval van L em>. infantum em>, het aantal DEG’s gevonden in de directe vergelijking van LiPro-Pper met LiPro-PNA – sup> was 285 bij de hierboven genoemde waarden voor de cutoff-expressie [ 25 ], vergelijkbaar met het aantal LiPro-Pper / LiPro-Stat DEG’s [ 7 ]. De meeste DEG’s waren verschillend tussen beide L em>. infantum em> datasets, die de bovengenoemde verschillen weerspiegelt die gevonden zijn in infectiviteit tussen deze promastigote populaties (LiPro-Pper> LiPro-PNA – sup>> LiPro-Stat). Alle L em>. major em> en L em>. infantum em> datasets zijn verschillend omdat verschillende stadia in beide gevallen zijn vergeleken. De DGE-analyse van LmSFMP / Lm-SFPP is bijvoorbeeld niet vergelijkbaar met het LiPro-Pper / LiPro-Stat-onderzoek, omdat kweken in de stationaire fase meestal nectomonaden en metacycli bevatten [ 21 ] en waarschijnlijk lage hoeveelheden procyclische en leptomonaden. In een slRNA-seq-analyse van L em>. infantum em> vergelijken heterogene populaties van sand fly promastigotes (LisfPro) [ 69 ] uit de hele buik van P em>. perniciosus em>, met de heterogene promastigote populaties in  axenische cultuur (LiacPro), we observeerden ongeveer 950 genen die ≥2-voudig omhoog gereguleerd waren, wat 2,0 tot 3,6 keer hoger is dan verwacht in vergelijking met de vorige DGE-datasets over meer homogene promastigote populaties die elk ongeveer 300 graden [ 7 , 25 , 125 a >]. Daarom zijn de DGE-snelheden relatief niet erg hoog in Leishmania em> spp., Waaronder homogene en heterogene populaties (maximaal ongeveer 1.000 ° van de ongeveer 8.300 genen geannoteerd in de genoomsequenties). Samengevat, er zijn algemene concordanties en verschillen gevonden tussen studies over van zandvliegen afgeleide promastigoten, maar een vergelijkende interpretatie van studies moet voorzichtig zijn, rekening houdend met verschillende biologische vergelijkingen, herkomst en voorbereiding van monsterbronnen en technische benaderingen. P> Div>

Wat heeft transcriptome analyse geleerd? ? h2>

De micro-omgeving beïnvloedt de differentiatieprocessen van de parasiet [ 7 , 125 ]. Steady-state transcript-niveau veranderingen van de glucose-6-fosfaat N-acetyltransferase, de cytochrome oxidase subunit VI, de vacuolaire proton-translocatie pyrofosfatase en de amastine superfamilie genen, bij het vergelijken van promastigoten met amastigoten (alle verminderen in amastigoten behalve de amastinen), werden waargenomen wanneer promastigoten werden verkregen uit de SV van de zandvlieg [ 26 ] en uit culturen [ 8 ]. De meeste DEG’s tussen LiPro-Stat en amastigoten zijn echter niet samenvallend met DEG’s tussen LiPro-Pper en amastigoten. Up-regulatie van verschillende amastine superfamilie-genen in metacyclics uit de zandvlieg met betrekking tot metacyclische waarden uit de kweek in L em>. infantum em> [ 25 ] en met betrekking tot zandvlieg-procyclieken in L em>. major em> [ 125 ] levert aanvullend bewijs ter ondersteuning van de pre-aanpassingshypothese [ 8 , 13 , 26 , 139 142 ], die vooraf bestaat uit promastigote voorbereiding om te overleven in de fagocyten van de gastheer (dwz de amastigote stadium). De hoogste niveaus van amastine-transcripten worden gevonden in amastigoten in vergelijking met beide van zandvlieg afgeleide promastigoten [ 26 , 125 ] en gekweekte promastigotes [ 8 ]. P>

Celcyclusgerelateerde genen worden over het algemeen neerwaarts gereguleerd in LmSFMP en LmSFNP in vergelijking met LmSFPP en LmAM, wat in overeenstemming is met de replicatieve of niet-replicatieve status van deze fasen [ 125 ]. Steady-state transcriptniveau-vergelijkingen tussen procyclische en metacyclische promastigoten in de zandvlieggom (LmSFMP versus LmSFPP) [ 125 ] en in kweek (LmCMP versus LmCPP) [ 136 ] resulteerde in relatief vergelijkbare resultaten omdat er weinig verschillen tussen beide onderzoeken werden gevonden. Dit omvat transporters (pteridine transporter, nucleoside transporter 1, glucosetransporters lmgt1 en lmgt2, aminozuurtransporters en de ATP-bindende cassette transporter ABC10), signaalmoleculen (fosfoproteïnefosfatase en eiwitkinase LmjF.26.2570), calpaïne-achtige cysteïne peptidase LmjF .30.2040, inosine guanosine nucleoside hydrolase, P27 proteïne, H2B en H4 histonen, 4E-interacterend proteïne LmjF.25.2450, het membraangebonden zuurfosfatase 2 (MBAP2), en verschillende hypothetische eiwitcoderende transcripten. P>

Veel genen die betrokken zijn bij metacyclogenese (zie hieronder) zijn sterk up-gereguleerd in heterogene populaties van sand fly-afgeleide promastigotes (LisfPro) vergeleken met gekweekte promastigotes (LiacPro) [ 69 ] maar niet in meer homogene metacyclische populaties (LiPro-Stat versus LiPro-Pper , LiPro-PNA – sup> versus LiPro-Pper en LmSFMP / LmSFPP versus LmCMP / LmPro-Log) [ 7 , 25 , 125 ]. L em> vergelijken. infantum em> heterogene populaties bestaande uit alle promastigote ontwikkelingsvormen van de zandvlieg (whole-gut preparaten) en kweek (groeicurve mengsels), we hebben ook waargenomen dat gp63 en autophagy genen up-geregeld waren [ 69 ], evenals het HASP / SHERP em> -cluster. Zoals hierboven vermeld, zijn deze genen essentieel voor metacyclogenese, tenminste in L em>. belangrijkste em>. De resultaten van Inbar en collega’s [ 125 ] zijn in overeenstemming, omdat gp63 en opregulatie van autofagie-genen werden gevonden in LmSFNP. Bovendien vonden ze dat LPG3 em>, een gen dat essentieel is voor biosynthese en assemblage van GPI-verankerde glycoconjugaten, de expressiepiek in LmSFPP bereikt. Zandvlieg-afgeleide populaties verrijkt met metacyclische stoffen (LiPro-Pper) zijn infectiever dan kweken in stationaire fase (LiPro-Stat) en metacyclische verbindingen verkregen uit die populaties (LiPro-PNA – sup>) [ 7 , 25 ]. Autophagy, gp63 en HASP / SHERP em> opwaartse regulatie van genclusters in van zandvlieg afgeleide promastigoten vergeleken met gekweekte promastigoten, ondersteunt dat metacyclogenese succesvoller is in de zandvlieg dan in cultuur. Daarom heeft de micro-omgeving een belangrijke invloed op de differentiatie [ 7 ]. P>

SHERP is essentieel voor metacyclogenese in L em>. major em> [ 103 ]. Inbar en collega’s [ 125 ] hebben bewijsmateriaal onthuld ter ondersteuning van deze verklaring die bestaat uit SHERP em> up-regulatie in LmSFNP en LmSFMP, waarbij maximale niveaus worden bereikt in LmSFMP. L em>. infantum em> transcriptoomanalyse is ook in overeenstemming met de rol in metacyclogenese, maar SHERP em> transcripten zijn minder overvloedig in LiPro-Pper dan in LiPro-Stat [ 7 ], wat aangeeft dat de niveaus hoger zijn in nectomonaden en leptomonaden in kweek (belangrijke vormen in de stationaire fase vergeleken met metacyclische stoffen) dan in zandvlieg afgeleide metacyclische stoffen. SHERP em> wordt niet differentieel uitgedrukt tussen LiPro-Pper en LiPro-PNA – sup>, wat aangeeft dat verschillende micro-omgevingen geen invloed hebben SHERP em> expressie in L em>. infantum em> [ 25 ]. Promastigote kweken in de stationaire fase bevatten meestal nectomonade promastigoten [ 21 ], terwijl de meeste promastigoten die zijn afgeleid van de SV van de zandvlieg en zijn geïsoleerd met behulp van de PNA-negatieve selectiemethode, metacyclisch zijn . HASP-A1 em> wordt ook neerwaarts gereguleerd in LiPro-Pper versus LiPro-Stat [ 7 ], wat leidt tot dezelfde conclusie over metacyclogenese omdat dit ook een essentieel gen is voor dit proces (zie hierboven). L em>. infantum em> sfPro versus acPro (heterogene populaties) transcriptome analyse komt ook overeen met de vorige studies omdat SHERP em> up-gereguleerd is in sfPro (dat wil zeggen, metacyclogenese vindt meer plaats in zandvlieg dan in cultuur). Interspecies vergelijking moet voorzichtig zijn, zoals eerder vermeld. SHERP em> -gegevens komen overeen met L em>. major em> en L em>. infantum em> met het eerder vastgestelde idee over de noodzaak van metacyclogenese, maar tegelijkertijd heeft transcriptoomanalyse specifieke verschillen blootgelegd. p>

Genen die betrokken zijn bij vetzuur biosynthetische processen worden opgewaardeerd in zandvlieg afgeleide metacyclische stoffen in beide L em>. infantum em> en L em>. major em> [ 7 , 125 ], maar de de hoogste niveaus van deze transcripten worden bereikt in LmSFNP. Volgens DGE kan het glucosekatabolisme niet alleen sterker zijn in LmSFPP dan in LmSFMP [ 125 ], maar ook in gekweekte dan in zandvlieg afgeleide promastigoten (LiPro -Stat versus LiPro-Pper) [ 7 ]. Bepaalde aminozuurbiosyntheseprocessen lijken actiever te zijn in kweken volgens DGE [ 7 ]. Genen die betrokken zijn bij ATP-synthese-gekoppeld protontransport worden opwaarts gereguleerd in zandvliegmetacycli (LiPro-Pper versus LiPro-Stat en LiPro-Pper versus LiPro-PNA – sup>). Volgens relatieve infectiviteit (LiPro-Pper> LiPro-PNA – sup>> LiPro-Stat) zijn zandvliegmetacycli “meer metacyclisch” dan metacyclische cultuur. Deze bevindingen komen overeen met de aanzienlijke energievereisten voor hoge motiliteit die wordt toegeschreven aan metacyclische promastigotes [ 14 ]. P>

Confrontatie van de transcriptomen en infectiviteit van zandvlieg afgeleide promastigoten met gekweekte promastigoten [ 7 ] is in overeenstemming met het principe van niet-gelijkwaardigheid van promovendi in de stationaire fase die worden ondersteund door Gossage en collega’s [ 14 ]. Beide transcriptomen vertoonden een matige correlatie in genexpressie en 286 °, en de infectiviteit was ongeveer 30% -50% hoger in LiPro-Pper. Op basis van deze resultaten werd gepostuleerd dat de geschiktheid van axenische promastigoten afhankelijk kan zijn van elk specifiek experimenteel doel en ontwerp [ 7 ]. De karakteristieke transcriptoomprofielen die worden gevonden in LmSFPP, LmSFNP en LmSFMP [ 38 ] zijn waarschijnlijk ook een gevolg van hun aanpassing aan de verschillende micro-omgevingen in de vector. In feite werden 72 van de 108-graden gevonden in LmCM / LmPro-Log [ 136 ] niet gevonden onder de 398-graden gevonden in LmSFMP / LmSFPP, zoals hierboven vermeld. Inbar en collega’s [ 125 ] hebben LmSFMP versus LmSFPP differentiële expressie-analyse uitgevoerd en gegevens vergeleken met een analoog experiment met gekweekte parasieten (LmCMP versus LmCPP) [ 136 ]. Beide onderzoeken werden uitgevoerd met behulp van dezelfde RNA-seq-procedure. Deze gegevens zijn niet vergelijkbaar met LiPro-Pper versus LiPro-PNA – sup> promastigotes omdat dit een directe vergelijking is [ 25 ] en deze populaties zijn niet genormaliseerd naar hun oorspronkelijke procyclische promastigote vormen. Met andere woorden, het vergelijken van met zandvlieg afgeleide en van cultuur afgeleide metacyclische verbindingen komt niet overeen met het vergelijken van de verschillen tussen metacyclische en procyclische verbindingen in beide omgevingen, tenzij procyclische cellen uit de kweek exact gelijk waren aan procyclics in de zandvlieg, wat zeer onwaarschijnlijk is. Verschillende isolatiemethoden kunnen ook van invloed zijn op de resultaten (zie het vorige gedeelte). P>

Een aanzienlijk aantal van de DEG’s is betrokken bij signaaltransductie en genexpressie regulatie bij de posttranscriptionele , translationele en posttranslationele niveaus tussen gekweekte en van zandvlieg afgeleide promastigoten [ 7 , 25 a>]. De biologische implicaties van deze bevindingen blijven echter onbekend (zie hieronder). De bevinding dat bestaat uit translationele efficiëntie die lager is in gedifferentieerde niet-deelnemende metacyclische epimastigoten dan in ongedifferentieerde delen van Trypanosoma cruzi em> epimastigoten [ 143 , 144 ] moet als leidraad dienen voor de interpretatie. p> Promastigotes scheiden constitutief exosomen uit in het darmkanaal van het zand. Coinoculatie van gekweekte L em>. major em> promastigotes met sand fly uit darm L em>. major em> exosomes leidt tot grotere voetzoollaesies bij muizen [ 145 ]. Deze exosomen bevatten gp63 en andere virulentiefactoren [ 146 150 ]. Deze onderzoeken geven aan dat het exosome-gehalte van een parasiet immunomodulerende en signaleringsinducerende activiteiten heeft. Exosomen worden uitgescheiden uit multivesiculaire lichamen (MVB’s) en de flagellar pocket. Eiwitgehalte van kweek- en zandvliegafgeleide promastigote exosomen lijkt sterk op elkaar [ 145 ]: gp63, dat wordt uitgescheiden in de middendarm en bijdraagt ​​aan egestion [ 151 ]; HSP70 [ 152 ] en HSP83 [ 145 ]; calpaïne-achtige cysteïne peptidasen [ 153 ]; tryparedoxin peroxidase [ 154 ]; en eiwitten van het oppervlakte-antigeen [ 155 ]. Transcripten die coderen voor deze eiwitten werden ook gevonden verhoogd in sfPro versus acPro [ 69 ]. P> Div>

Onbeantwoorde vragen over ontwikkeling en metacyclogenese in de zandvlieg darm h2>

Metacyclische promastigotes zijn gedefinieerd door morfologie, maar hun moleculaire kenmerken zijn niet volledig bekend. PNA-scheiding is effectief om zeer infectieuze promastigoten te verkrijgen omdat PNA – sup> promastigoten meer infectief zijn dan PNA sup> in zowel L em>. major em> [ 22 ] en L em>. infantum em> [ 24 ], maar de subpopulaties verkregen door deze procedure zijn mogelijk niet volledig equivalent in andere soorten. Een belangrijke LPG-rol in parasiet-vectorinteractie is alleen goed gedefinieerd voor L em>. major em>, terwijl de parasiet-interactiemechanismen onbekend blijven bij alle andere soorten. LPG-onafhankelijke promastigote ontwikkeling is aangetoond in tolerante vectorsoorten (zie sectie “Zandvlieg- Leishmania em> interacties”). Zeer infectieuze (en dus metacyclische) promastigoten die zijn geïsoleerd met behulp van de PNA-negatieve selectieprocedure zijn dus mogelijk in L em>. infantum em> [ 24 , 118 , 156 ], die zich meestal ontwikkelt in tolerante vectoren zoals P em>. perniciosus em>. Alternatieve onbekende mechanismen nemen deel aan herkenning omdat LPG niet strikt vereist is voor ontwikkeling, en het belang van dit molecuul is gedegradeerd tot L em>. major em> alleen [ 31 ]. Het wordt echter geproduceerd in alle soorten Leishmania em>. Onbekende PG-receptoren herkennen de LPG in de zandvliegbuik [ 115 , 117 ] , die ten minste een extra functie heeft die fungeert als een schild tegen proteolytische activiteit tijdens de eerste L em>. belangrijkste em> ontwikkelingsstadia (zie de sectie ‘Sand fly- Leishmania em> interacties’) en vermoedelijk in L em>. infantum em> omdat beide het herhaalde sleutelwoord (Gal-Man-PO 4 sub>) in de LPG-structuur bevatten [ 114 ]. Variatie van de LPG-structuur (zie “Het axenische kweekmodel: Sterktes en beperkingen”) in de laatste stadia naar de metacyclische fase maakt negatieve selectie met PNA mogelijk bij beide soorten. Verrassend konden PNA – sup> en PNA sup> subpopulaties worden geïsoleerd in de monoxeneuze parasiet C em>. fasciculata ​​em> [ 121 ], een feit met een onbekende betekenis die suggereert dat PG-derivaten die in staat zijn om te agglutineren met de PNA meer dan één functie kunnen hebben . De LPG-functie bestuderen in C em>. fasciculata ​​em> kan leiden tot het verhogen van andere benaderingen voor het zoeken naar LPG-interacties en alternatieve functies in verschillende soorten Leishmania em>. High-throughput vergelijkende metabolomics-benaderingen kunnen nuttig zijn om deze vragen te beantwoorden, maar niet de benaderingen van de transcriptomica. Rekening houdend met deze overwegingen, stellen we voor dat de rol van het gemodificeerde lpg in dit stadium niet noodzakelijkerwijs hetzelfde is tussen soorten, zoals al eerder is aangetoond voor het ongewijzigde lpg. Daarom stellen we dat de “metacyclische status” van PNA – sup> van L em>. infantum em> hoeft niet noodzakelijk hetzelfde te zijn als voor PNA – sup> van L em>. major em>, omdat de moleculaire markers en infectiemechanismen verschillend kunnen zijn, afhankelijk van de soort. Dit is niet verrassend, omdat elk soortencomplex verschillende pathologieën veroorzaakt en nauwkeurige metingen die de metacyclische promastigote infectiviteit van elke soort vergelijken niet mogelijk zijn. Het pinda-lectine heeft een verschillende affiniteit voor LPG van een verschillende oorsprong, omdat verschillende substituties van het molecuul disaccharideskelet worden gevonden, afhankelijk van de soort (zie “Het axenische kweekmodel: Sterke en zwakke punten”). In ieder geval L em>. major em> [ 22 ] en L em>. infantum em> PNA – sup> promastigotes [ 24 ] is aangetoond infectiever te zijn dan PNA sup> promastigotes. p>

Bij vergelijking van de heterogene populaties LisfPro en LiacPro door slRNA-seq, een groep genen direct betrokken bij metacyclogenese bleek sterk upgereguleerd (≥4-voudig) [ 69 ], wat suggereert dat ze nodig zijn tijdens de meeste stadia van de ontwikkelingsfase proces in de zandvlieg darm vergeleken met cultuur, niet alleen in de laatste ontwikkelingsstadia. Dit omvat vijf van de 14 autofagie-genen, vier van de acht gp63-genen, het HASP-gencluster ( HASPA1 em>, HASPA2 em>, HASPB em>, respectievelijk, LinJ.23.1200, LinJ.23.1220 en LinJ.23.1240), één op de drie membraangebonden zuurfosfatasen (LinJ.28.2850), alle drie apicale membraanantigeen 1 (ama1, LinJ.30.1470, LinJ.30.1480 en LinJ.30.1490 ) eiwitten en het META-domein bevattende eiwit 2 ( META2 em>, LinJ.17.0970) gen. Zowel kleine voor hydrofiele oppervlakte-eiwit coderende genkopieën ( SHERP em>, LinJ.23.1210 en LinJ.23.1230) zijn niet opgenomen in de LisfPro versus LiacPro DEG-reeks volgens de 2-voudige drempelwaarde die is opgelegd, maar zij nog steeds statistisch significant ongeveer 1,5-voudig hogere niveaus in sfPro versus acPro [ 69 ]. Overwegende dat SHERP em> duidelijk is up-geregeld in L em>. major em> metacyclics (LmSFMP versus LmSFPP en LmCMP versus LmPro-Log) en, in mindere mate, in nectomonaden (LmSFNP versus LmSFPP) [ 125 , 136 ], verschillende expressieprofielen die een overexpressie maximum ondersteunen in nectomonaden (LiPro-Pper versus LiPro-Stat) [ 7 ] (zie de redenen in de vorige sectie) werden waargenomen in L em>. infantum em>. Hoewel de specifieke SHERP em> expressieprofielen verschillend zijn, zijn beide in overeenstemming met SHERP-essentialiteit in metacyclogenese [ 103 ]. Gekweekt en zandvlieg afgeleid L em>. infantum em> en L em>. major em> metacyclics reguleren op differentiële wijze SHERP em> expressie (LiPro-Pper versus LiPro-PNA – sup>, en vergelijking tussen LmSFMP versus LmSFPP en LmCMP versus LmCPP). Interessant is dat beide SHERP em> genen naar boven worden geregeld in LiPro-Stat versus LiPro-Log van deze soort volgens microarrayanalyse [ 8 ] en verdere bevestiging door qPCR in twee onafhankelijke werken [ 24 , 157 ]. Dit komt overeen met de bewering dat de reeks nectomonaden, leptomonaden en metacyclische stoffen SHERP em> opwaarts reguleert in vergelijking met procyclics. SHERP em> is een goede metacyclogenese marker, maar geen metacyclische marker omdat het tot overexpressie wordt gebracht in meer dan één promastigote vorm (nectomonaden en metacyclicen). De gegevens suggereren dat de genpatronen voor SHERP em> overeenkomsten vergelijkbaar zijn tussen L em>. major em> en L em>. infantum em>, behalve dat de promastigote-vorm de maximale expressieniveaus bereikt, die eerder een piek hebben in L em>. infantum em> dan in L em>. belangrijkste em>. Dit zou niet verrassend zijn als het in de toekomst wordt bevestigd gezien de verschillende biologische affiniteit voor vectoren en verschillende ontwikkelingsprocessen van beide soorten, resulterend in verschillende ziekteprogressie bij zoogdiergastheren. Deze waarnemingen zijn in overeenstemming met het feit dat de kenmerken en het gedrag van metacyclische promastigoten kunnen variëren tussen soorten en niet volledig bekend zijn. Ze zijn bijvoorbeeld zeer besmettelijk of infectiever dan andere promastigote vormen, maar door hoeveel? Welke moleculen zijn echte markers van metacyclische vormen in elke soort? P>

Het META1 em> gen is beschreven om specifiek te worden uitgedrukt in de metacyclisch stadium in de kweek, maar de high-throughput DGE-studies van L em>. infantum em> en L em>. major em> hebben dit resultaat niet bevestigd op transcriptniveau in sand fly-afgeleide promastigotes [ 7 , 25 , 125 ]. Zoals eerder vermeld en hieronder besproken, zijn studies op het eiwitniveau zoals Western-blot of proteomische benaderingen tot nu toe niet haalbaar. Ongeveer de helft van de genen geannoteerd in de Leishmania em> spp. genomen coderen voor hypothetische eiwitten, meest onbekende biologische rol in de parasiet. Deze waarnemingen geven een idee van hoe weinig bekend is over ontwikkeling binnen de zandvliegvector. P>

Opheldering van processen waarbij de onbekende relatie tussen externe stimuli uit de micro-omgeving, de niet-gekarakteriseerde detectie van de parasiet is betrokken en intracellulaire signaleringsmechanismen, en de ongebruikelijke regulatieregelingen voor genexpressie die in deze organismen worden aangetroffen (herzien in [ 134 , 158 ]) kan waarschijnlijk helpen om de promastigote ontwikkeling binnen de zandvlieg darm verder te illustreren. Voor deze doeleinden is opheldering van signaaltransductieroutes en de onderliggende mechanismen die genexpressie regulatie beïnvloeden essentieel omdat meer cruciale genen in ontwikkeling kunnen worden gevonden. P> Div>

Translatome en proteoom analyse: een grote uitdaging h2>

In een experiment waarin DGE-analyse wordt gecombineerd door middel van DNA-microarrays en kwantitatieve proteomics met polysoomprofilering in L em>. donovani em>, Lahav en collega’s [ 132 ] hebben waargenomen dat genexpressie regulatie wordt uitgevoerd op de posttranscriptionele, translationele en posttranslationele niveaus, leidend tot om te vinden dat slechts 25% van transcriptniveaus kwantitatief gecorreleerd waren met de overeenkomstige eiwitniveaus, zoals eerder vermeld. Daarom is DGE op de translationele en posttranslationele niveaus meer direct gerelateerd aan fysiologische veranderingen van de verschillende levenscyclusstadia dan op posttranscriptioneel niveau. Een compleet beeld van DGE zou worden verschaft door gecombineerde transcriptoom, translatome en proteoomanalyse. Polysoomprofilering is een benadering voor het meten van translationele efficiëntie die bestaat uit de scheiding van mRNA-ribosoomcomplexen (polysomen) op basis van hun molecuulgewicht door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor daaropvolgende kwantificering van de fracties en high-throughput analyse van de mRNA-moleculen in elke fractie . De procedure vereist ongeveer 4 x 10 8 sup> cellen (50 ml bij een optische dichtheid van OD 600 nm sub> = 0,6) in het geval van Saccharomyces cerevisiae em> [ 159 ]. Omdat het gemiddelde celvolume van deze gistsoorten ongeveer 900 μm 3 sup> is en het gemiddelde volume van een Leishmania em> spp. cel is ongeveer 65-75 μm 3 sup>, in principe zouden ongeveer 10 keer meer promastigoten of amastigoten nodig zijn. p>

Ribosome-profilering is een meer specifieke high-throughput-benadering voor het meten van translationele efficiëntie. De bescherming van mRNA-sequenties door ribosomen wordt gekwantificeerd met behulp van NGS uit een ribosoom-voetafdrukbibliotheek gecombineerd met een gefragmenteerde mRNA-bibliotheek [ 160 ]. De eerste ribosoom-profileringsstudies in trypanosomatiden hebben aangetoond dat veranderingen in eiwitproductie tussen slanke bloedbaan en procyclische stadia van T em>. brucei em> zijn uitgebreider dan wordt aangegeven door transcriptome profiling [ 135 , 161 ]. Bij deze benaderingen werden ten minste 10 sup> parasieten per monster gebruikt om de ribosoom-voetafdruk en de gefragmenteerde mRNA-bibliotheek te genereren. Jensen en collega’s [ 135 ] brachten ook de 5′-uiteinden van mRNA’s in kaart door middel van slRNA-seq. Dezelfde algemene bevinding werd gerapporteerd voor T em>. cruzi em> [ 144 ], waarin een grotere hoeveelheid parasieten werd gebruikt. Bijgevolg is ribosoomprofilering niet haalbaar voor onderzoeken in Leishmania em> spp. promastigoten verkregen uit de zandvlieg tot nu toe. In feite zouden zoveel als ongeveer 10 sup> geïnfecteerde zandvliegen vereist zijn om genoeg promastigoten te verkrijgen voor een replica van een ribosoombepalingsexperiment, en zouden veel meer zandvliegen nodig zijn voor ribosoomprofilering van meer homogene populaties, bijvoorbeeld ongeveer 10 6 sup> voor metacyclics. p>

Typische voorbeelden voor proteoomanalyse vereisen ongeveer 1-2 × 10 8 sup> Leishmania em> spp. cellen voor zowel tweedimensionale op elektroforese gebaseerde strategieën [ 162 ] en kwantitatieve proteomics strategieën [ 163 ]. Hoewel dit ongeveer een tiende tot een vijfde van de benodigde hoeveelheden voor translatome analyse is, geven de getallen nog steeds aan dat proteoomanalyse ook niet mogelijk is voor promatigoten die zijn afgeleid van zandvliegen. Zelfs western-blot-semikwantitatieve analyse van enkelvoudige eiwitniveaus is tot nu toe niet getest en zou zeer uitdagend, zo niet onmogelijk zijn. Ondanks dat de aanpak erg gevoelig is, bestaat de uitdaging erin om voldoende monsters te nemen en de hoeveelheden in monsters gelijk te maken om ze vergelijkbaar te maken. Daarom kunnen tot nu toe alleen transcriptieniveaus worden geanalyseerd. Hoewel transcriptoomanalyse zeer informatief is en veel strategieën gebaseerd op deze benadering kunnen worden ontwikkeld (bijv. DGE van knock-out of knock-in promastigote cellijnen binnen de zandvliegvector) leidend tot significante biologische bevindingen, de afwezigheid van laag aangevoerd translatome en proteoombenaderingen impliceren dat veel fysiologische aspecten van promastigote ontwikkeling in de zandvlieg darm nog lange tijd onontgonnen blijven. p> Div>